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産品名稱:SE無縫克隆和組裝試劑盒 SE Seamless Cloning and Assembly Kit(ZC231)

貨号 規格 價格 訂購數量 是否現貨
ZC231-1 20次 420 - + 有貨
ZC231-2 60次 1050 - + 有貨

■ 産品簡介

本産品利用高效重組酶和同源重組原理,隻需DNA插入片段末端與載體末端具有15-20個同源堿基序列,就可以在載體的任意位點完成目的片段與載體的克隆重組。本産品可實現1-4個片段的高效無縫拼接;采用非連接酶克隆體系,可極大地降低載體的自連,保證産品克隆陽性率在90%以上。


■ 産品特點

1. 靈活的克隆位點:任何載體的任意位置。

2. 快速簡便:30分鐘完成載體構建。

3. 精确:不會增加任何額外的程序。

4. 效率高:高達90%陽性克隆率。


■ 無縫克隆流程圖



■ 常見問答


1、“同源序列”指的是特殊序列嗎?

答:無縫克隆要求的同源序列不是某個特殊序列,簡單講同源序列可以直接理解為“相同序列”,即DNA片段的連接處有15-20個相同的序列。


2、最佳克隆位點選擇?

答:在選擇克隆位點時,應避免選擇上下遊50bp内有重複序列的區域。當克隆位點上下遊25bp區域内GC含量均在40%-60%範圍内時,重組效率将達到最大。若高于70%或者低于30%,重組效率會受到較大影響。


3、同源序列的長度與退火溫度計算?

答:同源序列長度推薦15-20bp。實驗結果顯示,低于15bp(如10bp),轉化率明顯下降;大于20bp(如30-40bp),轉化效率差異不大,考慮成本,不推薦20bp以上。

計算擴增引物退火溫度時,隻需計算基因特異性擴增序列的Tm值,末端同源序列不應參與計算,為了得到高效率克隆,建議Tm≥48℃。


4、無縫克隆插入片段的最短長度?

答:建議插入片段≥100bp。


5、PCR擴增産物帶A尾(或者其他尾)是否影響無縫克隆?

答:任何PCR酶擴增産物都可以用于無縫克隆,無需考慮産物末端有無A尾 (重組過程中将被去除,在最終載體中不會出現)。但為了減少擴增突變或者産物要求高保真時,建議使用高保真聚合酶進行擴增。


6、 酶切産物做無縫克隆是否要做去磷酸化處理?

答:不需要。


7、PCR産物做無縫克隆是否要切膠純化?

答:PCR産物同時滿足以下條件時,産物純化即可,不必切膠純化:

A、PCR模闆不為質粒或者質粒抗性不同于目标載體;

B、無明顯雜帶且主帶占95%以上。


8、無縫克隆長斑數較少?

答:主要可能有以下幾種情況:

1)引物設計不合适:推薦【同源序列(15-25 bp)+完整的酶切位點+基因特異性擴增引物】,GC含量40% - 60%。

2)感受态細胞效率低:使用新鮮制備或妥善凍存的感受态細胞,确保其轉化效率>107 cfu/μg。每次操作時可設置一組轉化質粒的對照實驗,以檢測感受态細胞的轉化效率。選擇克隆感受态細胞(如DH5α),不能選擇表達感受态細胞。

3)線性化載體和插入片段擴增産物的使用量不足/過量,或者比例不佳:盡量按照推薦的量和比例配制重組反應體系。

4)線性化載體和插入片段擴增産物不純,抑制反應:線性化載體和插入片段擴增産物未純化,直接使用時,使用總體積應不超過反應體系體積的1/5,如10μL體系不超過2μL。建議線性化載體、插入片段擴增産物進行凝膠回收純化,純化産物溶解在ddH2O中。


9、出現較多假陽性?

答:主要有以下幾種可能情況:

1)載體線性化不完全:即使是痕量未完全酶切的載體也會産生很高的轉化背景。可通過陰性對照檢測載體是否線性化完全,優化酶切體系,提高限制性内切酶使用量、延長酶切反應時間、膠回收純化酶切産物等都可以有效減少環狀質粒殘留。

2)插入片段擴增産物混有非特異擴增産物。建議:①優化PCR體系,提高特異性;②膠回收PCR産物;③鑒定更多克隆。

3)反應體系中混入了相同抗性的質粒:PCR擴增模闆(載體或插入片段)為環狀質粒時,若擴增産物直接用于重組反應,殘留環狀質粒模闆會産生較高的轉化背景。建議擴增産物進行DpnI消化或擴增産物進行膠回收純化。


10、菌落PCR無條帶?

答:主要有以下可能情況:

1)引物不正确:推薦使用載體的通用引物或至少使用一條通用引物進行菌落PCR檢測。

2)PCR體系或程序不合适:沒有目的條帶也沒有空質粒條帶。建議優化PCR體系、程序;或者提取質粒,以質粒做模闆PCR驗證;或者進行酶切驗證。

3)重組失敗:沒有目的條帶,隻有空質粒的條帶。說明重組不成功,載體線性化不完全,建議優化酶切體系。